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液体分析技術

液体用のNMR分光法

NMR分光法が最も多く用いられているのは、溶媒に溶解した試料を使用した液体の研究であり、明確な高分解能データを収集することができます。一方、固体のNMRでは、ベースラインNMR磁場に対する分子の方向による信号の変動を考慮しなければなりません。液体では、分子の高速回転によって、これらの異方性(方向依存性)成分が平均化されて0になります。その結果として、液体NMR分光法では明確な多重線(マルチプレット)とともに狭いスペクトル線が得られ、核間および電子間の相互作用の詳細が明らかになります(これに似た効果は、マジック角と呼ばれる特定の角度で試料を高速回転させることによって、固体NMRで得られる場合もあります)。

パルスシーケンス

シンプルな一次元溶液NMR実験の概要は、NMR 101をご参照ください。

NMR実験におけるRFパルスのタイミング、周波数および強度によって、核がどのような影響を受けるか、また、環境のどの側面を観察できるかが決定します。

溶液NMR実験で解明される重要な要素を、以下に示します。

電子間相互作用:

移動する荷電粒子と同様に、付近の電子は原子核に印加される局所磁場に影響を及ぼします。これは、その核の標準値に対する共鳴周波数のシフトとして、NMRスペクトルに現れます。化学シフトと呼ばれるこのシフトは、ppm単位で表される小さな影響です。多くの有機物を含む小型の分子は、1H NMRスペクトルの化学シフトのパターンによって特定できます。

核間相互作用:

磁性核は、双極子カップリングまたはスピン‐スピン結合と呼ばれる現象において、相互に影響を及ぼします。NMRスペクトル上で、スピン結合は単一ピークから2つ以上のサブピークに分かれます。これらの核から生成する磁場の相互作用による直接結合から核間の距離に関する情報が得られ、したがって、分子のジオメトリに関する情報が得られます。分子内の電子上の各磁性核の影響によって、J結合と呼ばれる間接結合が生じ、これが他の核の磁気環境に影響を及ぼします。J結合は、水素結合などの少数の結合によって結びついた核間でのみ生じます。1H NMRにおけるプロトンのグループ間のJ結合は、多重線(マルチプレット)と呼ばれる一連の近接したピークを生成し、これは高分解能である溶液NMRでのみ観察可能です。

各タイプのNMR実験では、標的核に関する特異的な情報を得るために、1つ以上の特有のパルスシーケンスを用います。

水素NMR

高感度でシャープな信号を生成するプロトン(1H)NMRは、最も一般的なタイプのNMR実験です。1H NMR用の試料は通常、バックグラウンド信号を低減するために、重溶媒に溶解しなければなりません。

1H NMR spectrum for ethanol, showing spin coupling (green H signal split into sub-peaks). (Image by T.vanschaik (Own work) [GFDL or CC BY-SA 3.0], via Wikimedia Commons.)
スピン結合(サブピークに分かれた緑色のH信号)を示すエタノールの1H NMRスペクトル。(T.vanschaikによる画像(自著)[GFDL または CC BY-SA 3.0]、出典:Wikimedia Commons)

炭素13およびその他の元素

13C NMRは1H NMRよりはるかに低感度ですが、化学シフトの範囲は大きく、1Hピークがオーバーラップを生じる大型の分子では、高い柔軟性が得られます。典型的な13C実験では、化学シフトを予想される部分と比較します。

原則的に、NMRは、ほぼすべての元素の同位体を含むあらゆる磁性核からの信号を捕捉できます。重い元素からの反応には長時間(13Cの自由誘導減衰には約8秒)を要するので、良好なS/N比を得るために十分な繰り返しによるデータ収集には数分間~数時間を要する場合があります。

13C NMR spectrum for ethanol, showing chemical shift (PPM) of carbon nuclei. (Image by Chris Evans [CC0], via Wikimedia Commons.)
炭素核の化学シフト(PPM)を示すエタノールの13C NMRスペクトル(Chris Evansによる画像 [CC0]、出典:Wikimedia Commons)。

多次元NMR

タンパク質や核酸などの大型の分子の場合は、単回収集(single-acquisition)スペクトルに多くの核からのオーバーラップ信号が多く現れます。多次元NMR実験では、 同じタイプの核(同種核)‐多くの場合は1H‐または異なるタイプの核(異種核)‐1Hや13Cなど‐をそれぞれ標的とした2つ以上のパルスシーケンスによる結果の相関を評価することによってこの問題に対処できます。

多次元NMRには多くのバリエーションがあり、磁性核間の様々な相互作用とそれらの電子環境を利用しています。典型的な二次元NMR実験では2回の実験を行い、適切なディレイ時間をおいた一連の一次元シーケンスの後に、2回の結果の相関を解析します。三次元以上の実験では、数種間の関係を評価することによって分子構造内の特定の核の位置を特定することができます。

構造研究

多次元NMR実験では、大型の生体分子の三次元構造の決定および構造活性相関の研究が可能です。たとえば、三重共鳴NMRを用いて、医薬品候補物質の曝露前後のタンパク質コンフォメーションを比較することができます。この状況では、1H、13Cおよび15Nを標的としたパルスシーケンスを用いて、タンパク質内の特定の原子間の関係を特定および確立することによって、構造およびコンフォメーションを解明します。同様に、糖質または核酸の構造を決定するために一連の一次元、二次元および三次元NMR実験を実施することができます。

NMR実験では一般に13Cおよび15Nで生体分子を標識します。12Cは天然に多く存在しますがNMR不活性であり、14N核は四重極磁気モーメントを持つので複雑なNMR反応を生じます。

動的NMR

化学反応の時間推移を研究するためのNMR法は、タイムスケールによって異なります。数秒間~数分間の遅い反応の場合は、NMRを用いて反応生成物の濃度の経時的変化をモニターすることができます。ミリ秒以下のプロセスでは収集時間が数秒のNMRの平均的な結果が得られ、数ミリ秒間~数秒間で起こる化学的現象ではNMRの線が拡大します。これらの場合は、通常はNMRスペクトルを時間の関数として比較することによって反応平衡および速度定数を導き出すことができます。